Receptpligtigt RNA

Det er champagne for alle. Phil Zamore springer proppen ud af en flaske Montaudon og gennemvæder det splinternye tæppe. Alle i hans laboratorium fylder et glas for at skåle for chefen. Uventede gode nyheder, forklarer han. Zamore, en biokemiker ved University of Massachusetts Medical School i Worcester, har netop modtaget en national pris på 1 million dollars over fem år. Laboratoriets budget er lige blevet tredoblet.

Zamore er forståeligt nok svimmel, og det handler ikke kun om pengene. Zamores felt, RNA-interferens eller RNAi, er kun et par år gammelt, men det har taget biologiens verden med storm. RNAi er den mest spændende indsigt i biologi i det seneste årti eller to, siger nobelpristageren Phillip Sharp, biolog ved MIT. Og Zamores laboratorium er et af en håndfuld, der flytter feltet fremad i et svimlende tempo. Jeg tror, ​​at alle, der arbejder i marken, føler sig en smule forpustede af fremskridtet, siger Zamore.

Denne historie var en del af vores decembernummer 2002

• Se resten af ​​problemet
• Abonner

Den følelse af begejstring, som Zamore, Sharp og andre forskere deler, er velbegrundet. I årtier troede forskere, at RNA blot var DNA's budbringer, der slavisk leverede DNA's proteinplaner. Men det ser nu ud til, at bittesmå dobbeltstrenge af RNA, introduceret i laboratoriedyrkede celler eller dyr, hurtigt og effektivt kan slukke for ethvert givet gen.

Implikationerne er betagende, fordi levende organismer i vid udstrækning er defineret af den udsøgt orkestrerede tænding og slukning af gener. Biologer har indtil nu kun været i stand til at efterligne denne skiftproces på en langsom, tung og indirekte måde. Men den lethed, hvormed RNAi kan slukke for gener, siger forskere, virker næsten mystisk. Laboratorieteknikker ved hjælp af RNAi er allerede biologers foretrukne metoder til at opdage funktionerne af bestemte gener. Og det lover en ny måde at behandle sygdomme direkte ved at lukke ned for nøglegener involveret i forskellige lidelser. Allerede nu arbejder mindst otte virksomheder - inklusive en grundlagt af Zamore, Sharp og kolleger - på RNAi-terapier til alt fra virussygdomme til kræft.

Den hellige gral skal udvikle alt dette til stoffer, siger Zamore. At være i stand til at give dig et lille interfererende RNA, der ville lukke for ekspression af dit højkolesterolgen. Det ville sænke niveauet af hepatitis C, der inficerer din lever. Eller måske, tror jeg, i måske den største pie-in-the-sky-applikation, der ville skærpe ind på et gen, der er specifikt for tumorceller og dræbe tumoren.

Hvor hurtigt dette kan ske er nogens gæt. RNA-interferens brød ind i den videnskabelige verdens bevidsthed ved det årlige møde i RNA Society i Banff, Alberta, i maj 2001. Sayda Elbashir, en postdoc i laboratoriet hos biokemikeren Thomas Tuschl ved Max Planck Institute for Biophysical Chemistry i Gttingen, Tyskland, forbløffede sine lyttere med nyheden om, at bittesmå dobbeltstrengede RNA-fragmenter hurtigt, nemt og specifikt slukkede for gener i menneskelige celler, en rolle forskerne aldrig før havde set RNA spille.

De fleste af tilhørerne sad bare og sagde til sig selv: Videnskaben har lige ændret sig,« husker biokemikeren David Engelke fra University of Michigan. Det eneste, der forhindrede pandemonium, var, at vi var blevet lovet den slags før. Skeptisk ventede Engelke et par måneder. Så begyndte disse rapporter at sive ind: Puha, det her virker virkelig!'

RNA-overraskelsen

Indtil for nylig var den ret uglamorøse rolle, biologer havde tillagt RNA, rollen som en passiv budbringer, der leverede genetisk information fra DNA til cellens proteinfremstillingsmaskineri. I denne proces transskriberes et gens DNA-kode til en RNA-kopi, som det cellulære maskineri omsætter til et protein. Ved RNA-interferens blokerer korte stykker RNA processen ved at ødelægge beskeden undervejs. De dobbeltstrengede RNA-fragmenter fører skærende enzymer til det RNA, der bærer det genetiske budskab. Messenger-RNA'et hugges derefter op og markeres til destruktion: genets budskab dæmpes effektivt.

Biologer har i årevis vidst, at enkeltstrengede RNA-molekyler designet til at parre sig med et messenger-RNA kunne lukke proteinproduktionen ned, men denne kunstige proces er upålidelig selv i laboratoriet. Naturen regulerer dog gener ved hjælp af RNA, specifikt dobbeltstrengede molekyler.

De første antydninger af fænomenet dukkede op tilbage i 1990, men på det tidspunkt forbandt forskere ikke, hvad de havde observeret, med RNA. Det år forsøgte plantebiolog Rich Jorgensen, dengang hos DNA Plant Technology i Oakland, CA, at gøre lilla petunia til en dybere lilla nuance. Han indsatte en ny, superladet kopi af genet, der styrer produktionen af ​​lilla pigment. Til sin overraskelse fik han hvide petuniaer. Jørgensen erkendte vigtigheden af ​​denne paradoksale effekt, men han kunne ikke forklare, hvorfor tilføjelse af mere af et gen havde slået det gen fra.

Det næste spor kom i 1995, da genetikere ved Cornell University klonede et gen i den mikroskopiske jordorm C. elegans . For at bekræfte deres opdagelse brugte de en standard laboratoriemetode til at slukke for genet: de tilføjede en enkelt RNA-streng, der matchede messenger-RNA'et. Denne komplementære streng bandt sig til budbringeren og forhindrede den i at blive oversat til et protein. Uventet lukkede en ikke-komplementær enkeltstreng af RNA, de brugte som en eksperimentel kontrol, og som ikke burde have gjort noget, også genet.

I 1998 løste biokemiker Andrew Fire, dengang ved Carnegie Institution of Washington, og genetiker Craig Mello, ved University of Massachusetts Medical School, mysteriet. Ved at injicere komplementære enkeltstrenge af RNA i orme fik de en forbløffende potent lyddæmpende effekt, når de to strenge blev kombineret. Efter at have demonstreret, at dobbeltstrenget RNA var det egentlige lyddæmpningsmiddel, opfandt Fire og Mello udtrykket RNA-interferens, og et nyt felt blev født. Set i bakspejlet gav Jorgensens superladede lilla gener dobbeltstrengede RNA'er, der havde samme effekt på de oprindelige lilla gener, hvilket i det væsentlige lukkede dem af.

Det dobbeltstrengede RNA så ud til at give et mere stabilt og pålideligt middel til at lukke for specifikke gener end de enkelte strenge, og laboratorier, der studerede organismer, herunder planter, orme og fluer, tog ivrigt imod den nye metode. RNA-interferens virkede dog ikke hos pattedyr: immunsystemet ødelægger celler, der indeholder dobbeltstrenget RNA for at forsvare sig mod RNA-vira som dem, der forårsager hepatitis A og C. Så kom Tuschl og Elbashirs åbenbaring i Banff, at meget korte RNA-segmenter, som de kaldte lille interfererende RNA, virkede i menneskelige celler. På det tidspunkt, siger Sharp, tog hele feltet fart.

Lydløs behandling

Nu leder efterforskerne efter måder at omdanne denne kraftfulde nye rolle for RNA til virksomhedsoverskud. Stort set alle lægemiddelvirksomheder bruger allerede RNA-interferens som et værktøj til lægemiddelopdagelse. En af de mest populære strategier til at finde nye lægemiddelmål involverer at slå generne ud eller deaktivere én efter én for at se, hvad der sker. Hvis for eksempel et sygt dyr kan helbredes ved at slå et bestemt gen ud, kan det gens protein være et godt lægemiddelmål. Brug af små interfererende RNA'er, viser det sig, kan radikalt fremskynde denne proces. I stedet for at bruge måneder eller år på at konstruere en knockout, bruger forskere RNA'erne til specifikt og hurtigt at slukke for et gen. De kan også observere, om at slukke for proteinet - som et lægemiddel ville - forårsager bivirkninger. Processen foregår i løbet af få dage i stedet for et år, siger Christophe Echeverri, administrerende direktør for Cenix BioScience, en biotekvirksomhed i Dresden, Tyskland.

I den ultimative anvendelse kan små interfererende RNA'er i sig selv være lægemidler: I stedet for at blokere et bestemt protein, som standardlægemidler gør, ville RNAi forhindre, at proteinet nogensinde bliver fremstillet. Sidste juni viste MIT's Sharp, at sådanne RNA'er, målrettet mod vigtige virale og menneskelige gener, kunne stoppe HIV-infektion i celler dyrket i laboratoriet. I et eksperiment blandede forskerne HIV-inficerede celler med små interfererende RNA'er målrettet mod virale gener. RNA'erne standsede viral reproduktion. Sharps gruppe blandede også uinficerede celler med små interfererende RNA'er målrettet mod CD4, et protein på overfladen af ​​celler, hvorigennem HIV kommer ind. Forskerne viste, at RNA'erne reducerede produktionen af ​​CD4. To en halv dag senere udsatte de RNA-behandlede celler og ubehandlede celler for HIV. Virusset inficerede fire gange så mange ubehandlede celler.

På trods af de opmuntrende resultater er RNAi-lægemidler indtil videre stadig i drømmestadiet, siger Sharp. Men Sharp anså det tidlige løfte for fristende nok til at udvikle sådanne lægemidler sammen med Zamore, Tuschl og to andre forskere - Alnylam Pharmaceuticals i Cambridge, MA. Virksomheden var knap på vej, da den sikrede sig 17 millioner dollars i venturekapitalfinansiering i juli sidste år.

At lave RNAi-lægemidler vil dog ikke være let. For det første har ingen fundet metoder, der er egnede til at administrere RNA'erne til mennesker. Der er et leveringsproblem. Så enkelt er det, siger kemiker Stuart Schreiber fra Harvard University. At få nukleinsyrer til deres målvæv [er] et uløst problem i medicin. RNAi-terapi er i bund og grund genterapi, siger Schreiber, og den vil stå over for de samme problemer - ineffektivitet, ineffektivitet og immunologiske bivirkninger - som har stoppet dette felt siden 1999, da Jesse Gelsinger døde under et genterapiforsøg ved University of Pennsylvania. Læger der brugte modificerede vira som transportmidler eller vektorer til at transportere DNA ind i teenagerens celler. Gelsingers immunsystem reagerede massivt og dødeligt.

Sharp siger, at håbet er, at små interfererende RNA måske ikke har brug for vektorer for at nå sit mål, og dermed undgår de fleste af faldgruberne forbundet med DNA-baseret genterapi. Men det scenarie er langt fra sikkert. Kan du modificere RNA'er for at gøre dem mere stabile [og] for at få dem til at blive optaget mere effektivt af celler? spørger Sharp. Vi ved det ikke.

Giver mening

Nyere biomedicinsk historie hjælper ikke med at afgøre usikkerheden. Faktisk er det ikke første gang, videnskabsmænd har forsøgt at lave et lægemiddel baseret på at dæmpe RNA. Enkeltstrenget antisense RNA eller DNA kan også lukke ned for gener - og behøver ikke en vektor. Inde i cellen finder et antisense-molekyle dets komplementære budbringer-RNA, og ligesom to sider af en lynlås binder de sig tæt, hvilket forhindrer budbringer-RNA'et i at gå gennem cellens proteinfremstillingsmaskineri. Resultatet er i hvert fald i teorien gennedlukning.

Antisense har dog hidtil været en skuffelse som grundlag for nye lægemidler. Efter mere end et årti med intenst udviklingsarbejde har kun ét antisense-lægemiddel - Isis Pharmaceuticals' Vitravene, til behandling af visse sjældne øjeninfektioner hos AIDS-patienter - vundet Food and Drug Administration-godkendelse. Den første generation af antisense-lægemidler, som blev testet i begyndelsen af ​​1990'erne, blev hurtigt nedbrudt i kroppen, var svære at få ind i cellerne, kunne ofte ikke finde deres mål og forårsagede alvorlige bivirkninger. Mere stabile antisense-lægemidler bliver nu testet på mennesker.

Kan RNAi klare sig bedre end antisense? Ikke på noget tidspunkt, forudser Frank Bennett, vicepræsident for antisense-forskning hos Isis. Hvis man sammenligner RNAi med den nuværende version af antisense, er der virkelig ingen fordel, siger han. [Lille forstyrrende] RNA-teknologi er virkelig i sin vorden. Det svarer lidt til, hvor antisense var for 10 år siden, da vi lige var begyndt at lave forsøg med dyr.

Men RNAi-folk ser deres teknologi som fundamentalt forskellig fra antisense. Den store fordel her ved RNAi frem for antisense er, at det her faktisk virker virkelig, siger Cenix CEO Echeverri. RNAi, siger han, er langt mere potent og pålidelig end antisense. Antisense-projekter blev typisk set som selvmordsprojekter, siger han. Du kunne bruge meget tid på at få det til at virke, og det ville aldrig fungere. Du vil ikke stå tilbage med intet at vise. RNAis større styrke, mener Echeverri, burde give bedre behandlinger. Og fordi der vil være brug for mindre medicin for at dæmpe et gen, burde der være færre bivirkninger.

Folk har kæmpet med antisense, og her kommer en teknologi, der virkelig virker, er enig Jon Wolff, chief scientific officer for Mirus, et RNA-terapeutisk firma i Madison, WI. Antisense er svært at reproducere, men RNAi er noget, der virker lige ud af tønden.

Men kunne RNAi bare være endnu en overhypet teknologi? Beviset er i buddingen, siger Echeverri. I løbet af de sidste to, tre år har RNAi netop overtaget fuldstændigt. Alle henvender sig til det; i hver organisme, de prøver det. Og det ville ikke være så populært, hvis det ikke var vellykket.

At dæmpe tvivl

Ingen har endnu prøvet RNAi i mennesker, men én virksomhed er tæt på: Ribopharma, en biotekstartup i Kulmbach, Tyskland. Mere end et år før Tuschls gruppe forbløffede det videnskabelige samfund med sine nyheder, opdagede Ribopharmas grundlæggere, tidligere Bayreuth University-lektorer Roland Kreutzer og Stefan Limmer, at små RNA'er virkede i pattedyrsceller. Eller det hævder Kreutzer og Limmer. De har aldrig offentliggjort deres data.

Kreutzer og Limmer begrundede, at det var fysisk umuligt for de meget lange RNA'er, såsom dem, der blev brugt af Fire og Mello, at binde alle på én gang til deres mål-RNA'er. Kun korte segmenter ville holde fast. Så de forsøgte at dæmpe pattedyrsgener ved hjælp af RNA'er, der er korte nok til at undgå det fatale immunrespons. Det var gambling, siger Limmer. Og det viste sig, at det virkelig virker. Forskerne indgav en patentansøgning, sagde deres lærerjob op og grundlagde i juni 2000 Ribopharma.

Ribopharmas principper planlægger at påbegynde forsøg med mennesker næste år, sandsynligvis begyndende med test af små interfererende RNA'er i behandlingen af ​​malignt melanom og bugspytkirtelkræft. Kreutzer og Limmer siger, at deres RNA-konstruktioner er stabile nok til at fungere uden vektorer og kan injiceres direkte på stedet for en tumor eller i blodbanen. Virksomheden har rejst mere end 18 millioner dollars. Men fordi Ribopharma endnu ikke har offentliggjort sine resultater, er det svært at evaluere dets påstande, siger andre RNA-forskere. De har gjort nogle ting, siger MITs Sharp, ganske pænt...[Men] det er en lang vej.

Hvor længe? Holdningerne spænder fra Ribopharmas klare forsikringer til stærk pessimisme. David Beach, præsident for RNAi-startup Genetica i Cambridge, MA, peger på antisenses årti-plus-odyssé. Jeg vil ikke sidde og argumentere for at implementere RNAi i en terapeutisk tilstand ville være nemmere, siger han.

Hvad der er langt tydeligere er, at RNAi tvinger biologer til at genoverveje RNAs rolle. I de sidste par år har forskere fundet hundredvis af gener, der koder for små RNA-molekyler, kaldet mikroRNA'er, i organismer lige fra planter og orme til mennesker. Ligesom deres små interfererende RNA-fætre ser mikroRNA'er ud til at dæmpe gener, men deres rolle i biologien er for det meste ukendt. Mange af dem er blevet meget højt bevaret i løbet af evolutionen; [så] de må gøre noget vigtigt, siger MIT-biolog David Bartel. I mellemtiden har erkendelsen af, at RNAi er en naturlig - og sandsynligvis fundamental - proces i planter og dyr, været med til at gøre det til et af de mest spændende mysterier i nutidens biologi.

Små RNA-gener kan være den biologiske ækvivalent af mørkt stof - overalt omkring os, men næsten undslippe påvisning, skrev Gary Ruvkun, en molekylærbiolog fra Harvard Medical School, i 2001 i tidsskriftet Videnskab . Hvad laver disse mystiske gener? Jeg formoder, at det, vi kigger på, er en meget gammel metode til at kontrollere genekspression, siger Zamore.

Hvis mikroRNA'er er switches, der bestemmer, om stamceller bliver til neuroner eller muskler, eller om kræftceller vokser eller dør, så er RNA-interferens meget vigtigere, end nogen forestillede sig for bare et par år siden. Vi faldt simpelthen over en helt ny gren af ​​molekylærbiologi, som vi ikke kendte til før, siger Michigans Engelke.

For optimisterne varsler disse gennembrud den hurtige udvikling af effektive lægemidler. Og selv biomedicinske forskere, der er blevet kyniske af ekstravagante påstande om magiske kure, tror, ​​at RNAi bare kan være den ægte vare. Sidste år, da RNAi først arbejdede i menneskelige celler, vågnede alle op og sagde: Mon det her er sølvkuglen?’ siger Engelke. Og det kan det være. Det kan være.

Virksomheder, der udvikler RNA-interferens SELSKAB PRIMÆR RNAi FOKUS Alnylam Pharmaceuticals
(Cambridge, MA)
Terapeutik Benitec
(Brisbane, Australien)
Intellektuel ejendomsret til genomik og terapeutik Cenix BioScience
(Dresden, Tyskland)
Identifikation af lægemiddelmål og behandlinger for kræft Devgen
(Gent, Belgien) Identifikation af lægemiddelmål og behandlinger for diabetes, depression og Parkinsons sygdom Genetik
(Cambridge, MA)
Identifikation af lægemiddelmål for kræft Mirus
(Madison, WI)
Terapeutik ved hjælp af langt dobbeltstrenget RNA ribopharma
(Kulmbach, Tyskland) Terapeutik til kræft og hepatitis C

skjule