Sekventering i et flash

Den 6. februar 2007 viste ledere fra 454 Life Sciences den 78-årige James Watson et første udkast til sit eget genom. Der var noget direkte poetisk over dette. Watson havde selvfølgelig vundet en Nobelpris 45 år tidligere for sin rolle i at opdage den dobbeltspiralformede struktur af DNA; han var også en primus motor bag Human Genome Project, som ved sin afslutning i 2003 havde brugt næsten 3 milliarder dollars over 13 år på at udtrække den plan, som disse helixer koder. Nu havde 454 bevæget sig et skridt ud over det megaprojekt, som samlede mange menneskers DNA for at bestemme den genetiske sekvens af, hvad der svarer til et modelmenneske. Virksomheden og dens såkaldte næste generations sekventeringsmaskine havde på egen hånd læst den genetiske kode for en person - en hvis arbejde havde gjort så meget for at gøre præstationen mulig.

454s Jonathan Rothberg mener, at hans maskiner vil gøre sekventering så billig og hurtig, at det bliver praktisk at aflæse individers genomer.

Men Jonathan Rothberg, der grundlagde 454 i Branford, CT, med drømmen om at producere en sekventeringsmaskine, der er mere effektiv end dem, der er tilgængelige for Human Genome Project, nævner ikke poesi, når han fortæller om sit møde med Watson. Snarere taler han om penge, hastighed og en fremtid, hvor almindelige mennesker bærer rundt på deres personlige genomer på diske – et stadig mere plausibelt scenario. Det kostede os 200.000 dollars at lave Jim Watson, påpeger Rothberg. Og det gjorde vi mest i december og januar.

Denne historie var en del af vores maj 2007-udgave

• Se resten af ​​problemet
• Abonner

Rothberg, som nu er formand for 454’s bestyrelse, understreger, at Project Jim fortsat er et igangværende arbejde og vil kræve mere tid og penge. Fra februar havde virksomheden kun sekventeret Watsons DNA tre gange (hver gang øgede nøjagtigheden og udfyldte huller); ni gennemløb var påkrævet for at producere Human Genome Projects endelige udkast til sekvens. Men stadig.

Rothbergs virksomhed er blot en af ​​flere, herunder Illumina fra San Diego og Applied Biosystems fra Foster City, CA, der udvikler maskiner, der kan afkode DNA hurtigere end nogensinde før. Og ligesom omkostningerne til computerkraft er styrtdykket med den støt stigende tæthed af transistorer på chips, er prisen på sekventering af DNA faldet hurtigt med disse maskiners fremkomst. I dag vil prisskiltet på et menneskeligt genom, der er afkodet med sequencere af den type, der bruges i Human Genome Project, være på 25-50 millioner dollars. Det falder til omkring 1 million dollars med næste generations maskiner, der er tilgængelige i dag og kan være så lavt som 100.000 dollars i 2008.

Multimedier

• Se en grafik af sekventeringens hemmeligheder.

Som computerhistorien har vist, kan mere processorkraft for færre penge føre til uventede applikationer. I kølvandet på Human Genome Project stod forskerne over for vanskelige økonomiske beslutninger om, hvilke genomer der skulle sekvenseres næste gang: chimpanse eller makak, ko eller delfin, ris eller kassava. De nye maskiner gør det muligt at sekvensere næsten alt af interesse. Og efterhånden som flere og flere sekvensdata flyder ind i databaser, åbner der sig helt nye forskningsområder. Forskere har nu en hidtil uset evne til at foretage sammenligninger mellem arter og kaste lys over alt fra evolutionære spørgsmål til genetiske årsager til individuelle forskelle i sygdomsresistens og modtagelighed. Forskning udført med 454's maskiner og offentliggjort i toptidsskrifter inkluderer delvis sekventering af et neandertalergenom og udvikling af nye tests for kræftfremkaldende genetiske mutationer – teknologi, der kan hjælpe læger med at skræddersy behandlinger til deres patienter.

Det sidste år har været den mest spændende periode inden for genomik siden Human Genome Projects dage, siger Eric Lander, førsteforfatter på projektets første offentliggjorte udkast til det humane genom og nu leder af Broad Institute for genomisk medicin i Cambridge, MA. . Sekvensering bliver billig nok og kraftfuld nok til, at den kan anvendes på ethvert problem. Den står feltet på hovedet. Francis Collins, der ledede Human Genome Project for National Institutes of Health, forudsiger, at de nye sekventeringsteknologier vil have dybtgående konsekvenser for fremtiden for biomedicinsk forskning og i sidste ende for udøvelse af medicin.

En unik løsning
Jonathan Rothbergs kontor har et diner-tema med et rød-og-sort skakternet flisegulv, røde Naugahyde-beklædte kromstole og en sofa med arme, der imiterer bagenden af ​​en 1959 Cadillac, komplet med monsterhalefinner og kugleformede baglygter . I stedet for et skrivebord har han en spisebar med barstole. Vinflasker fra en vingård i Connecticut, som han ejer, står på nogle af hylderne. Bagved vinduerne ligger Long Island Sound. Stedet skriger Jeg er unik . Og det er Rothberg også. I 1991, mens han færdiggjorde sin ph.d. i biologi ved Yale University, startede han CuraGen, en af ​​de første virksomheder, der udviklede lægemidler baseret på genomik. Udover CuraGen og 454 Life Sciences har han grundlagt et institut til undersøgelse af børnesygdomme og endnu en biotekvirksomhed, RainDance Technologies, som har udviklet, hvad det kalder flydende printkort, der er designet til at gøre eksperimenter mere effektive ved at manipulere små mængder af væske. Og alt det i en alder af 43.

Faktisk var det en interesse for hver enkelt persons unikke karakter, der i sidste ende fik ham til at forsøge at designe en sequencer, som han håber en dag vil foretage genomkontrol lige så rutinemæssigt som blodprøver er nu. Rothberg holder 454-maskinens indvolde op, et objektglas med 1,6 millioner miniaturebrønde, hver cirka 50 mikrometer bred (ca. halvdelen af ​​bredden af ​​et menneskehår) og 55 mikrometer dyb. Det er denne chip, der gør det muligt for maskinen at sekventere DNA så hurtigt, fordi en separat kemisk reaktion kan udføres i hver brønd.

Gensekventering udnytter det faktum, at de to strenge i en DNA-helix er komplementære: af de fire kemiske baser adenin, guanin, thymin og cytosin, som er spændt sammen i forskellige rækkefølger på hver streng, parrer adenin kun med thymin, og kun guanin med cytosin. I den mest almindeligt anvendte sekventeringsteknik, som bygger på et skema udviklet for 30 år siden af ​​University of Cambridges Frederick Sanger, adskilles fragmenter af DNA i enkeltstrenge og udsættes for frie nukleotider, som binder til de originale As, Cs, Ts, og G'er for at generere nye komplementære tråde. Disse strenge varierer i længde, fordi nogle af de frie nukleotider er blevet modificeret for at forhindre reaktionen i at fortsætte; når en af ​​disse baser binder sig til sit mål, holder kæden op med at vokse. Og hver af disse fire typer kædeterminatorer har en forskellig fluorofor, der fluorescerer, når den rammes af en laserstråle. En elektrisk strøm adskiller strengene efter størrelse, og laseren aflæser farverne for at bestemme, hvilken base der var den sidste base, der blev tilføjet til hver kæde, og udskriver sekvensen. Langt de fleste laboratorier, der laver sekventering i dag, bruger en maskine lavet af Applied Biosystems, der spytter omkring to millioner baser ud om dagen.

Den seneste sequencer fra 454 kan læse 300 millioner om dagen.

454-metoden undgår flere af de mere tidskrævende trin ved konventionel sekventering, såsom adskillelse af strenge efter størrelse. I modsætning til Sanger-sekventering afslutter den ikke kæder: den registrerer baser, når de føjes til en voksende streng. Først skæres et DNA-molekyle tilfældigt i forskellige længder. Derefter strippes hvert fragment i enkeltstrenge, og hver streng fæstnes til en separat lille perle. En biokemisk proces kopierer de enkelte strenge, så 10 millioner kloner stikker ud fra hver perle. Hver perle pakkes derefter i en af ​​de 1,6 millioner brønde. Som, Cs, Ts og Gs vaskes over brøndene sekventielt for at syntetisere nye komplementære strenge.

Her er den virkelig smarte del: Ved at bruge en metode, der først blev beskrevet af Pål Nyrén og kolleger på Sveriges Kungliga Tekniska Högskola, registrerer 454's sequencer øjeblikkeligt, når en base føjes til hver streng ved at udnytte det faktum, at bindingsreaktionen frigiver et kemikalie kaldet et pyrophosphat. I brøndene i 454-maskinen fanges pyrophosphaten af ​​en kemisk kaskade, der ender med at svirpe på enzymet luciferase (som forekommer naturligt i ildfluer) - og udsender et lysudbrud. En standard ladningskoblet enhed af den slags, der bruges i digitale kameraer og teleskoper, registrerer hver blitz og aflæser sekvensen af ​​As, Cs, Ts og Gs i hvert fragment. Processen kan læse omkring 200 til 300 baser i træk. Som i konventionel sekventering leder computere derefter efter matchende sekvenser i slutningen af ​​et fragment og starten af ​​et andet, og samler fragmenterne sammen i den rigtige rækkefølge.

Sequenceren, som 454 bragte på markedet i oktober 2005, havde et par alvorlige begrænsninger. Den kunne kun læse 100 baser i træk (jo længere strækningen af ​​baser er i hvert sekventeret fragment, jo nemmere er det at samle et komplet genom), og det havde også problemer med nøjagtigt at kortlægge gentagne strækninger – for eksempel seks som ryg mod ryg. Men Rothberg siger, at 454s filosofi var Get it out early; få det accepteret. Virksomheden var først målrettet mod tidlige brugere som Broad's Lander i håb om, at de snart ville offentliggøre resultater, der var afhængige af sequenceren. Du er nødt til at få tidlige fyre først, men resten af ​​fyrene, følgerne, er, hvor markedet er, siger Rothberg. Og de læser fagfællebedømte artikler.

Neandertalere
Et papir fra en tidlig adopter, der fik udbredt opmærksomhed fra både videnskabsmænd og offentligheden, var en undersøgelse af neandertaler-DNA ledet af Svante Pääbo fra Max Planck Instituttet for Evolutionær Antropologi i Leipzig, Tyskland. Neandertalere, den art, der er tættest på moderne mennesker, forsvandt for omkring 30.000 år siden, og mere spekulation end fakta omgiver deres genetiske forhold til os. Selvom Pääbo havde lavet nogle tidligere undersøgelser med neandertaler-DNA, havde alt ud over rudimentær analyse vist sig for svært og dyrt. Problemet er, at over tusinder af år er de få kendte prøver af neandertaler-DNA fra fossiler blevet nedbrudt til korte fragmenter på omkring 50 til 75 basepar. Derudover er DNA'et ofte forurenet med genetisk materiale fra mikroorganismer og de moderne mennesker, der har håndteret fossilerne. Men Rothberg mente, at 454-maskinen kunne analysere mange korte sekvenser til lave omkostninger, og generere nok information til at lade videnskabsmænd sortere gamle skatte fra skrammel. Rothberg koldkaldte Pääbo, som gik med til at samarbejde.

Efter at have sekventeret gener fra 70 neandertaler-knogle- og tandprøver fandt Pääbos team og forskere fra 454 en prøve, anslået til at være 38.000 år gammel, som for det meste havde rent DNA. Som de rapporterede i et papir udgivet sidste efterår i Natur , sekventerede de derefter en million basepar fra mindre end 200 milligram materiale, en bedrift, der har givet spor om, hvorvidt moderne mennesker og neandertalere krydsede hinanden, og hvornår de to arter divergerede fra hinanden. Endnu vigtigere, papiret viser, at det er muligt at sekventere alle tre milliarder baser i neandertalergenomet. At gøre det kunne hjælpe med at løse sådanne mysterier som om neandertalere havde den genetiske evne til at tale.

At sortere ud af, om mennesker og neandertalere blandede sig eller endda havde kapacitet til at tale med hinanden, kan få meget presse- og offentlig opmærksomhed, men andre applikationer til ultrahurtig DNA-sekventering kan have en langt større indflydelse på medicin og på vores liv. Den traditionelle sekventeringsmetode ser på DNA fra mange forskellige celler. Men hvis en af ​​disse celler f.eks. er en tumorcelle, kan dens sekvens afvige en smule fra de raske cellers. I sådanne tilfælde vælger computerne den sekvens, der oftest findes, og kasserer de andre. Næste generations sequencere som dem, der markedsføres af 454, kloner og sekvenserer i stedet enkelte DNA-molekyler, hvilket tillader ultradyb sondering, der kan afdække sjældne varianter. (Traditionelle sequencere kan også analysere enkelte molekyler, men det er uoverkommeligt dyrt.) Implikationerne af enkeltmolekyle-sekventering er enorme for medicin. Selvom det ikke er praktisk at bruge konventionel sekventering til at opsnuse DNA-forskellene mellem raske og syge celler, kan de nye maskiner nemt udføre sådanne eksperimenter.

Matthew Meyerson, en klinisk patolog ved Dana-Farber Cancer Institute i Boston, har offentliggjort en undersøgelse, der viser, hvordan 454-maskinen kan hjælpe med at afdække mutationer forbundet med lungekræft. Lungekræftlægemidler, der nu er tilgængelige, retter sig mod det gen, som Meyerson sekventerer, og han håber, at lægerne i sidste ende vil få bedre styr på, hvem der vil reagere på hvilke lægemidler ved at lære, om patienten har en bestemt mutation. Jeg forestiller mig, at alle kræftpatienter om få år vil have deres tumorer karakteriseret ved enkeltmolekyle-sekventering, hvis teknologien fortsætter med at falde i omkostninger, siger han.

I en variation af dette tema har Michael Kozal, en AIDS-kliniker ved Yale, sluttet sig til 454 for at udføre ultradyb sekventering af HIV for at bestemme tilstedeværelsen af ​​mindre populationer af lægemiddelresistent virus. Tidlige test af teknikken hos patienter opdagede omkring dobbelt så meget resistent HIV som Sanger-sekventering gjorde. Denne information kunne også hjælpe læger med at individualisere behandlingsregimer, hvilket ville øge omkostningseffektiviteten. Det er praktisk at gøre i vores system, siger 454-chefforsker Michael Egholm, der samarbejder med Kozal. Før var det simpelthen ikke overkommeligt.

MyGenome
George Church, en sekventeringspioner ved Harvard Medical School, siger, at omkostninger er nøglen. Efterhånden som deres priser falder i de næste par år, siger han, vil disse maskiner blive en demokratiserende kraft, der vil gøre traditionelle sequencere næsten forældede, på samme måde som personlige computere fortrængte mainframes. Og det vil føre til ansøgninger, som ingen endnu kan gennemskue. Hvis vi stadig arbejdede med mainframes, ville der ikke ske en masse fede ting, siger han.

Church, som var blandt de dusin forskere, der foreslog Human Genome Project i midten af ​​1980'erne, er en af ​​de få biologer, hvis laboratorieudstyr omfatter et bordmonteret skruestik og en borepresse. Han bruger udstyr som dette til at bygge sin egen næste generation af sequencere, hvoraf hans laboratorium i øjeblikket har otte (se TR35, september/oktober 2006) . Han er overbevist om, at virksomheder tager for meget for deres maskiner, og gør det meget ud af, at han frit deler sin knowhow med interesserede kolleger. Han sammenligner sin filosofi med wiki- og Linux-mentaliteten og siger: Hvis en flok myrer samles, kan de flytte en gummitræplante.

Churchs store vision er at kanalisere den billige strøm af As, Cs, Ts og Gs ind i det, han kalder Personal Genome Project. I Human Genome Project indhentede forskere DNA fra flere personer, som hver af privatlivets fred forbliver anonyme. Så den endelige sekvens repræsenterer en sammensat person med et konglomerat af forskellige genetiske baggrunde og medicinske historier. Kirken ønsker, at hans personlige genomprojekt skal afkode individers DNA, som også vil frivilligt udlevere deres lægejournaler. Han vil sende alle de resulterende data på internettet. I sidste ende forestiller han sig, at millioner af mennesker vil slutte sig til projektet, lægge deres sekvenser, lægejournaler og, hvis de vælger, endda ansigtsfotografier online. Hele verden vil så have adgang til alle de data, den behøver for frit at teste hypoteser.

Selvom kirken har modtaget betydelige midler fra National Institutes of Health til at udvikle sekventeringsteknologi, har de etiske, juridiske og sociale spørgsmål rejst af det personlige genomprojekt afholdt NIH fra at støtte det, på trods af en positiv gennemgang af en ansøgning om tilskud i august 2005. Så snart jeg fik godkendelse, blev NIH helt begejstret, og ikke nødvendigvis på den gode måde, siger han. Han har forsøgt at løse problemerne med privatlivets fred og fortrolighed og bemærker, at ingens identitet skal offentliggøres, og at NIH allerede finansierer humangenetikprojekter, der har færre sikkerhedsforanstaltninger på plads.

Kirken erkender, at intim viden om deres eget DNA kan være for meget for mange mennesker. Du lader ikke dine børn browse på internetpornografiske sider, siger han, og til en vis grad tillader du ikke dig selv at browse på de mest uhyggelige, groveste sider. Han forventer, at i stedet for at få adgang til deres rå genom, vil folk få fagfolk til at hjælpe dem med at fortolke informationen.

På trods af manglen på føderal finansiering og de etiske indvendinger fortsætter Church, overbevist om, at fremskridt inden for sekventeringsteknologi vil drive ideen om et personligt genomprojekt fremad – ligesom fremskridt inden for informationsteknologi har fået fremmede til at dele data på måder, som ingen drømte om. af, da dual-floppy-drevet Apple II debuterede for 30 år siden. Efterhånden som sequencere bliver mere effektive, mener han, og omkostningerne fortsætter med at falde, vil personlig genomik tage fart i en skala, som få mennesker endnu har forestillet sig.

Vinder i lotteriet
Sidste oktober annoncerede X Prize Foundation en pris på $10 millioner for at producere meget nøjagtige sekvenser af 100 menneskelige genomer på 10 dage eller mindre uden at bruge mere end $10.000 pr. En af de første deltagere var 454, som planlægger at udvikle endnu mindre perler, som de håber vil give deres maskiner mulighed for at læse endnu mere DNA pr. kørsel til nogenlunde samme pris. Vi behøver ikke nogen ny fysik eller matematik for at komme til $1.000-genomet, siger Rothberg.

Hvis man ser bort fra spørgsmålet om hvornår – eller om – nogen vil gøre krav på X-prisen, vil DNA-sekventering helt sikkert fortsætte med at falde i pris og stige i nøjagtighed. Indtil sidste år kæmpede sekventering virkelig for at få den indflydelse på den næste æra af genomik, som den skulle have, siger David Bentley, Illuminas chefforsker. Grundlæggende faldt prisen på traditionel sekventering bare ikke hurtigt nok. Nu er feltet langt mere optimistisk, end det var, siger han. Næste generations sekvensering har en stor rolle at spille.

At høre videnskabsmænd sætte kryds ved mulighederne er som at lytte til lotterivindere. Og personlig medicin som den type kræfttest og behandling, som Dana-Farbers Meyerson håber at hjælpe med at indlede, er kun et udgangspunkt. Bentley siger, at de nye sequencere vil åbne vinduer på de enorme ikke-kodende regioner af genomet, der tænder og slukker gener. Egholm fra 454 bemærker, at Human Genome Project faktisk ikke sekventerede hver sidste bit af menneskets DNA; der kan stadig være uopdagede gener, som yderligere sekventering kan finde. Broad's Lander forestiller sig en strøm af ny information om, hvad der får en celle til at differentiere sig til en eller anden type (et centralt mysterium i udviklingsbiologi), og hvad der styrer forskellige cellulære tilstande. Jeg er klar over, at det er sværere at forklare end at helbrede kræft, siger han, men det er i sidste ende vigtigere, for det vil påvirke alle sygdomme.

Inden for det næste år, forudser Lander, vil forskere være i stand til at påbegynde undersøgelser, der genererer terabaser af information - en trillion As, Cs, Ts og Gs. Jeg talte aldrig engang ordet terabase før sidste år, siger han. Og hvis alle disse data er på nettet og frit tilgængelige, vil det drive en helt anden form for biologi.

Jon Cohen, en San Diego-baseret freelanceskribent og korrespondent for Videnskab , arbejder på en bog, der ser på de genetiske forskelle, der adskiller chimpanser fra mennesker.

skjule